PCR : Polymerase Chain Reaction
La PCR est une méthode de diagnostic génétique utilisée pour la recherche de certains agents infectieux (bactéries, virus) ou parasitaires, mais également le dépistage d'anomalies génétiques.
Principe
Le principe de la PCR repose sur l'amplification enzymatique in vitro par une enzyme (ADN polymérase) d'un court fragment du génome de l'agent recherché. On parle de RT-PCR lorsque le génome à rechercher est de l'ARN, ce qui est le cas pour certains virus. Avant les étapes enzymatiques d'amplification de la PCR, les acides nucléiques contenus dans le prélèvement à analyser sont extraits et purifiés. Au cours de la PCR ou à l'issue de celle-ci, différentes méthodes peuvent être mises en œuvre pour mettre en évidence les fragments amplifiés (hybridation, électrophorèse...).
Il existe ainsi différentes techniques de PCR qualitatives ou quantitatives (PCR en temps réel) qui peuvent être mises en œuvre pour la recherche du même agent pathogène.
Intérêt et performances
La PCR permet de détecter de très faibles quantités d'un génome exogène dans des prélèvements biologiques variés (sang, fluide biologique, cellules, organes, fecès...). Le seuil de détection est souvent de quelques copies de génome par analyse et il n'est pas nécessaire que l'agent recherché soit viable pour le détecter. Pour ces deux raisons, la PCR est un outil analytique souvent plus sensible que la mise en culture.
La spécificité est importante et peut être modulée en fonction de la région génétique amplifiée, des conditions de réaction, de la méthode de détection des fragments amplifiés.... Par exemple, il est possible avec certains tests très spécifiques de distinguer différentes souches d'un même virus (souches vaccinales / souches pathogènes).
Mise en œuvre pratique
La PCR est un outil de diagnostic direct, sensible et spécifique qui peut être utilisé à des fins diagnostiques, de dépistage ou en suivi de traitement. Afin d'obtenir des résultats interprétables, son utilisation ne peut cependant être envisagée que dans certaines conditions.
Choix du prélèvement : Il dépend de l'agent recherché, du test utilisé (donc du laboratoire), de la durée d'évolution des signes cliniques, de la finalité du test (diagnostic, dépistage ou suivi), du taux de portage asymptomatique dans la population pour le prélèvement choisi et éventuellement de l'historique vaccinal (utilisation de vaccins vivants).
Moment du prélèvement : La PCR est une méthode de diagnostic précoce (utilisable le plus souvent dès l'apparition des premiers signes : maladie de Carré, Parvovirose), mais également tardive dans les formes chroniques en raison de la sa sensibilité. Il est très important que les prélèvements soient réalisés avant la mise en place d'un traitement spécifique (antibiotiques lors de la recherche d'Ehrlichia ou de leptospires par exemple) pour éviter les faux négatifs. Dans le cas contraire, la méthodes sérologiques sont souvent plus intéressantes.
Interprétation des résultats
- De façon générale, en raison de la sensibilité importante de la PCR, les résultats positifs doivent être interprétés avec prudence (portage, vaccination récente avec un vaccin vivant). Ainsi, pour certaines recherches comme les parvovirus chez les carnivores, seuls les résultats quantitatifs sont interprétables.
- Un résultat négatif traduit l'absence de l'agent recherché ou une quantité inférieure au seuil de détection de la méthode dans le prélèvement analysé mais ne permet pas d'exclure avec certitude et dans tous les cas l'hypothèse d'une infection.
Exemple : Maladie de Carré
Diagnostic de la maladie de Carré
Prélèvements
Sang total sur EDTA (quelle que soit la forme clinique, y compris nerveuse pure).
Ecouvillons nasaux, oro-pharyngés ou conjonctivaux.
LCR (uniquement forme nerveuse), Organes (rein, foie, rate, poumon).
Interprétation des résultats
Résultat négatif : risque de faux négatif dans les formes chroniques évoluant depuis plus d'un mois et en phase de séquelles.
Résultat positif : risque de faux + si l'animal a été vacciné il y a moins d'un mois, surtout si il s'agit d'une primo-vaccination (les risque de faux + est écarté si le test permet de typer de la souche).
Exemple : PIF
Diagnostic de la PIF
La PCR ne distingue pas les coronavirus pathogènes responsables de PIF et les coronavirus entéritiques. Un résultat positif (et éventuellement la charge virale) dans un prélèvement choisi en fonction des signes cliniques permettent d'orienter le diagnostic.
Prélèvements
Forme humide : épanchement sur EDTA (éviter le sang total en raison des risques de faux négatifs)
Forme sèche : en fonction des signes
Signes généraux uniquement : sang sur EDTA (risque faux négatif > risque faux positif)
Signes oculaires/nerveux : humeur aqueuse / LCR (tube EDTA)
Biopsie rénale ou hépatique non formolée (congélation possible)
Interprétation des résultats
Un résultat négatif sur épanchement permet d'écarter l'hypothèse de PIF. Un résultat positif (associé le plus souvent à une charge virale élevée) confirme la suspicion.
Un résultat positif sur le sang est un résultat très en faveur d'une PIF (environ 5% des animaux asymptomatiques présentent une virémie toujours associée à une excrétion fécale très importante).
Un résultat négatif sur le sang ne permet pas d'écarter l'hypothèse de PIF (le pourcentage de faux négatifs dépend entre autre du seuil de détection du test). Il est recommandé de renouveler l'analyse quelques jours plus tard.
