Importance des conditions ''pré-analytiques'' en biologie vétérinaire
1. Concepts généraux
Le terme pré-analytique inclut tout ce qui se passe avant de procéder au test dans l'analyseur. Cela part donc de la qualité du prélèvement (exemple : prise de sang difficile), du type de tube utilisé, du volume de remplissage du tube, du délai d'envoi et inclut aussi les conditions d'envoi (gel, chaleur, lumière).
On mentionne souvent les trois conditions suivantes : la lipémie (=lactescence), l'hémolyse et l'ictère car elles sont trois principales conditions pré-analytiques qui risquent de fausser le résultat. Parmi elle l'hémolyse est probablement une des plus importantes.
Ces trois conditions peuvent être vues à la fois comme des variables analytiques qui interfèrent sur la performance du test (et la validité du résultat) et aussi comme des conditions pré-analytique qui peuvent souvent être atténuées avec quelques précautions.
Attention : l'effet de ces variables ''préanalytiques'' est dépendant de la méthode utilisée pour l'analyse. Certaines explications proposées ci-dessous ne s'appliquent pas de façon identique à un autre système d'analyseur.
Il est important de garder en mémoire que tout résultat de test obtenu par un analyseur (automate) ou autre méthode de lecture peut ne pas représenter la réalité. Un des rôles du biologiste est d'identifier ce genre de situation et de mettre en garde sur la validité de la valeur obtenue, voire même de rejeter le résultat.
Voici 3 types de situations dans lesquelles le résultat de biochimie peut être faussé :
1. D'autres substances, autre que celle dosée, sont présentes dans le prélèvement et viennent interférer avec la méthode de mesure de l'analyte d'intérêt.
- Ceci est particulièrement vrai pour toutes les techniques en spectrophotométrie lors d'hémolyse. La substance en question (hémoglobine) a alors un impact sur l'absorbance.
- Le résultat sera faussement élevé ou abaissé
- Il s'agit d'un vrai problème de condition pré-analytique et moins d'une interférence au sens strict.
2. Des substances présentes dans le prélèvement viennent réagir et former un composé qui est mesuré à la place ou en plus de l'analyte dont l'on souhaite connaitre la concentration.
- C'est la définition même ''d'interférence''
- En général le résultat est faussement élevé
- Il s'agit d'une interférence ''directe'' (variable analytique).
3. L'analyte d'intérêt se dégrade lorsque le prélèvement est un peu vieux ou s'il est consommé.
- En général le résultat est faussement abaissé.
2. Cas de la lipémie : origine et effet
On parle aussi de lactescence. Elle est causée par la présence de triglycérides (dont chylomicrons et VLDL). (Voir fiches 608 et 626).
Il s'agit d'un changement qui est le plus souvent post-prandial et physiologique (= non pathologique). Un jeun de 12 heures permet de l'éviter. En revanche, la lipémie chez un animal à jeun indique un trouble du métabolisme des lipides (exemple : diabète sucré, pancréatite, maladie hépatique telle que lipidose, néoplasme, hypothyroidie primaire canine, etc.)
Avec un prélèvement lipémique certains résultats peuvent être faussés de différentes manières :
1. Modification de l'absorbance
Dans de nombreuses réactions, l'absorbance de la solution contenant l'analyte d'intérêt est mesurée après (méthode ''endpoint'') ou pendant (méthode ''cinétique'') une réaction chimique, par spectrophotométrie. Cette absorbance est ensuite retranscrite en concentration de l'analyte.
Les gouttelettes lipidiques lors de lipémie modifient la quantité de lumière qui atteint le capteur, altérant ainsi la validité du résultat final. Le type d'altération (faussement haut ou faussement bas) est dépendant de l'analyse et de l'automate.
De très nombreux paramètres du bilan sont affectés et indiqués ''résultat sous réserve''. La fructosamine y est particulièrement sensible.
2. Effet de ''contraction''
Ceci est particulièrement vrai pour les électrolytes Na+ et Cl- du ionogramme, mesurés par potentiométrie indirecte (et photométrie de flamme). Ces appareils mesurent les concentrations sur le volume plasmatique total qui contient la portion aqueuse et la portion lipidique ''anormalement'' augmentée. Lors de la dernière étape du calcul qui prend en compte une certaine dilution, le résultat est faussement abaissé.
3. Synergie négative avec l'hémolyse
Ceci est particulièrement vrai pour les analyseurs par spectrophotométrie. De très nombreux paramètres y sont sensibles.
3. Cas de l'hémolyse : origine et effet
La plupart du temps l'hémolyse est un changement in-vitro strict, causé par une prise de sang difficile à réaliser / un diamètre d'aiguille inapproprié, un délai de séparation du sérum (ou plasma), une congélation ou une surchauffe accidentelle du sang total, un délai dans l'envoi/réception du prélèvement et enfin une lipémie (fragilisation des hématies).
Attention : dans quelques cas, une ''véritable'' anémie hémolytique peut en être la cause (exemples : babésiose, AHMI avec cellules fantômes, anémie à corps de Heinz.); le contexte clinique et d'autres résultats pourront aider à le déterminer ou non.
Il y a plusieurs mécanismes qui vont fausser certains résultats d'analyse lors d'hémolyse :
1. Modification de l'absorbance
Ceci est particulièrement vrai pour la mesure de la créatinine et des bilirubines. De nombreux autres paramètres y sont sensibles : lipase, amylase, cholestérol, triglycérides. Le degré d'hémolyse nécessaire pour altérer le résultat peut être variable.
2. Interférence et mesure directe de l'hémoglobine
Ceci est particulièrement vrai pour la mesure des protéines totales et la migration des différentes fractions protéiques lors de l'éléctrophorèse et la mesure de L'ALAT.
L'hémoglobine est une protéine. Avec l'hémolyse, des quantités considérables de cette molécule peuvent se retrouver dans le sérum/plasma et la mesure des protéines totales est donc faussement élevée. Plus l'hémolyse est forte, plus la valeur des protéines totales sera élevée (dépassant largement les valeurs physiologiques).
Sur l'éléctrophorèse, l'hémoglobine va migrer entre les globulines béta1 et béta2, plus rarement gamma. Il faut faire très attention car une hémolyse sévère peut s'accompagner d'un pic étroit en béta-globulines : il est prudent de ne pas conclure à un pic monoclonal ''néoplasique'' mais de recommencer le test sur un sérum ou un plasma de bonne qualité analytique.
3. Relargage de molécules d'intérêt diagnostique ou impliqués dans les réactions chimiques de l'analyseur
L'hématie contient de nombreuses molécules qui sont aussi souvent dosées car elles peuvent avoir une valeur diagnostique. Si le prélèvement est hémolysé : leur valeur sera faussement élevée. C'est particulièrement vrai pour :
Le potassium (chevaux, akita et shiba-inu), les folates, la LDH, l'ASAT, le fer et le phosphore dans une moindre mesure.
À noter que même si l'hémolyse est à peine visible, les concentrations d'ASAT et de LDH sont toujours faussées.
Commentaire : les analytes dont la mesure est la moins sensible à l'hémolyse sont : l'urée, l'albumine si elle est mesurée avec la méthode de référence et pas calculée via l'électrophorèse des protéines, la CRP, les PAL et la plupart des hormones dont cortisol et T4 totale.
4. Cas de l'ictère : origine et effet
Le cas de l'ictère est un peu différent car un prélèvement ictérique reflète souvent déjà un état pathologique alors que lipémie et hémolyse peuvent être des conditions physiologique pour la première et purement survenue in-vitro pour la seconde. Toutefois, l'ictère a pour principale conséquence une altération de l'absorbance qui va fausser la mesure de plusieurs analytes.
Ceci est particulièrement vrai pour la créatinine, qui peut être abaissée faussement.
5. Vieillissement du prélèvement
- Le glucose est consommé par toutes les cellules sanguines. Même si le tube fluoré permet de réduire cette réaction pendant quelques jours, il est tout de même préférable de centrifuger et séparer le plasma avant envoi. Sinon une valeur abaissée du glucose peut représenter un artéfact de consommation in-vitro plutôt qu'une véritable hypoglycémie.
- La bilirubine est labile et se dégrade au contact de la lumière. En pratique, cela arrivera rarement, sauf peut être pour les prélèvements en pratique équine qui peuvent parfois rester exposés trop longtemps à la lumière (et température inadéquate).
- Le NH3/NH4+ et l'ACTH sont très labiles. Idéalement, ils doivent être mesurés très rapidement et si possible, transportés réfrigérés.
6. Quelques astuces pour optimiser l'envoi des prélèvements et la validité des tests.
L'hémolyse peut fortement compromettre la validité de certains résultats. Il s'agit toutefois de l'altération in-vitro la plus fréquente. Elle peut aisément être évitée ou diminuée par quelques astuces :
1. Préférer une séparation du sérum ou du plasma avant l'envoi des prélèvements. Dans le premier cas, la coagulation et formation du caillot se produit normalement dans les premières 20 minutes après la prise de sang. Une centrifugation est recommandée puis un prélèvement du sérum uniquement avec transfert dans un tube sec. Dans le cas du tube hépariné, aucun caillot ne se forme. Il faut centrifuger le tube puis séparer le plasma dans un tube sec (attention! surtout pas un autre tube hépariné). Par principe, puisque le plasma ou le sérum envoyé ne sont plus en contact avec les hématies, le risque d'hémolyse supplémentaire est nul.
2. Diminuer le délai d'envoi du sang entier si la séparation du plasma ou sérum vous est impossible.
3. Rejeter un prélèvement avant même son envoi s'il semble trop hémolysé au risque de ''sur-interpréter'' des changements sur le bilan biochimique, qui sont possiblement artéfactuels.
Il n'y a pas vraiment d'astuce concernant la lipémie, sauf de s'assurer que l'animal est à jeun. S'il ne l'est pas, la lactescence peut être physiologique (post-prandiale) ou pathologique.
D'une façon générale, le délai entre envoi et réception devrait être diminué. Les longs week-ends et jours fériés, grèves, etc, peuvent causer des ralentissements de la réception des prélèvements. Dans de telles situations, et si une alternative existe pour délivrer plus rapidement d'échantillon, alors ceci devrait être préféré. Il est intéressant ici de rappeler que le génome est significativement altéré après 4 jours, ce qui peut compromettre la validité d'une PCR (augmentation du nombre de faux négatifs)
Il est aussi recommandé d'envoyer rapidement les prélèvements après collecte sur l'animal. Un délai supplémentaire au frigo ou sur un comptoir sont fortement déconseillés.
L'utilisation de tube périmé n'est pas encouragée.
Lorsque qu'un tube est rempli, il faut faire attention à ne pas ''contaminer'' le suivant. Par exemple si un tube EDTA est rempli en premier, suivi d'un tube hépariné, il faut faire attention à ne pas contaminer le second avec de l'EDTA. L'EDTA chelate le calcium. Une hypocalcémie artéfactuelle est possible. Le calcium est souvent impliqué dans de nombreuses réactions (enzymatiques notamment) et une fausse hypocalcémie peut altérer la mesure de certaines activités enzymatiques.
Enfin, concernant les bilans de coagulation, il est primordial de respecter le ratio optimal de sang par rapport à l'anticoagulant citrate, en remplissant le tube jusqu'au trait indiqué. En l'absence d'un remplissage optimal, les temps de coagulation sont très significativement augmentés.
